ddCAP-Verfahren

Das ddCAP-Verfahren (dual-directional CAPture) basiert auf der Hybrid-Capture-Technologie, bei der die Zielregionen der Ausgangs-DNA mithilfe von biotinylierten Sonden angereichert werden. Da hierbei nur mit einer einzelnen sequenzspezifischen Sonde anstelle von zwei Primern, wie bei amplikon-basierten Verfahren üblich, hybridisiert wird, ist mit dem ddCAP-Verfahren eine sehr umfassende Analyse von Genfusionen möglich. Zudem kann im Vergleich zu amplikon-basierten Methoden eine größere Zahl an Zielregionen parallel sequenziert werden. Die Vereinigung der Libraries vor der Capture-Reaktion, wie es beim ddCAP-Verfahren der Fall ist, ermöglicht außerdem eine sehr gleichmäßige Sequenzierung der Libraries und damit eine bessere Auflösung von Varianten. Das Verfahren ist daher sehr gut für die Sequenzierung von cfDNA aus Liquid Biopsies geeignet.

• Umfassende Analyse: Detektion von unbekannten Fusionspartnern

• Hohe Sensitivität: Teils auch für Liquid Biopsy-Proben geeignet

• Hohe Genauigkeit: Verwendung von UID-Sequenzen zur effizienten Identifizierung von PCR-Fehlern

• Flexible Verwendung: Alle AmoyDx® NGS-Assays sind in einem Sequenzierlauf kombinierbar und für viele gängige Illumina-Sequenzierplattformen geeignet

Zur Vorbereitung von genomischer DNA findet zunächst eine Fragmentierung der DNA durch Enzyme oder Ultraschall statt. Im nächsten Schritt, dem End-Repair, werden überhängende Enden der DNA-Fragmente mit einer Polymerase aufgefüllt, so dass glatte Enden („blunt ends“) entstehen.

Anschließend werden die Adapter mit PCR-Primer-Bindestellen mittels einer Ligase an die Enden der DNA-Fragmente angefügt. Die Adapter erhalten zusätzlich einzigartige UID (Unique IDentifier)-Sequenzen, mit deren Hilfe nach der Sequenzierung Artefakte, die während der Amplifizierung der Library und der Sequenzierung entstehen, bioinformatisch eliminiert werden. Durch eine anschließenden PCR mit wenigen Zyklen erfolgt die Amplifikation der DNA-Fragmente, bei der die Index-Sequenzen sowie die Bindestellen für die Sequenzierprimer und die Flow Cell hinzugefügt werden.

Nach einer Aufreinigung durch magnetische Beads werden die Proben in einem Reaktionsgefäß vereint. Für die Hybrid-Capture-Reaktion wird die DNA nun mit biotinylierten Sonden, die komplementär zu den Zielregionen der Ausgangs-DNA sind, über Nacht hybridisiert.  In der anschließenden Aufreinigung durch Sepharosebeads, dem „Capture“-Schritt, werden spezifisch die Fragmente angereichert, die die Zielregionen des Panels enthalten. Nach einer weiteren PCR und Aufreinigung können die Libraries sequenziert werden. 

Beim AmoyDx^® FGFR1-4 NGS Panel wird RNA für Fusionsnachweise zu Beginn des Workflows in cDNA umgeschrieben und vor dem End-Repair Schritt mit der fragmentierten DNA vereinigt (DNA/cDNA Co-Library Workflow).