HANDLE-Verfahren
Das HANDLE (Halo-Shape ANnealing and Defer-Ligation Enrichment)-Verfahren der AmoyDx® HANDLE NGS Kits ermöglicht die schnelle und flexible Herstellung von NGS-Libraries in nur 5-6 Stunden mit einer Stunde Hands-On Zeit. Bei dieser Technologie kommen DNA-Sonden zum Einsatz, die über eine Extension-Ligation-Reaktion eine PCR-freie Isolation der zu sequenzierenden genomischen Zielregionen ermöglichen. Alle Reaktionen finden in einem Reaktionsgefäß pro Probe statt, dadurch wird die Gefahr einer Probenverwechslung minimiert.
Vorteile des HANDLE-Verfahrens
Schnelles und flexibles Protokoll: Library-Herstellung innerhalb eines Arbeitstages mit mehreren Stoppmöglichkeiten
Hohe Sicherheit: Nur ein Reaktionsgefäß pro Probe minimiert die Gefahr von Probenverwechslungen, auch bei der Analyse von DNA & RNA
Geringer Arbeitsaufwand: Nur eine PCR-Aufreinigung am Ende der Library-Herstellung
Hohe Genauigkeit: Verwendung von UID-Sequenzen zur effizienten Identifizierung von PCR-Fehlern
Flexible Verwendung: Alle AmoyDx® NGS-Assays sind in einem Sequenzierlauf kombinierbar und für viele gängige Illumina-Sequenzierplattformen geeignet
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Eine HANDLE-Sonde besteht aus zwei DNA-Elementen, die komplementär zu den flankierenden Bereichen der Zielregion im Genom sind und durch einen Loop verbunden sind. Für eine optimale Sequenzierung von FFPE-Material sind die Regionen, die von den Sonden umfasst werden, durchschnittlich nur etwa 120 Nukleotide lang. Jede Sonde verfügt über eine einzigartige UID (Unique IDentifier)-Sequenz, mit deren Hilfe nach der Sequenzierung Artefakte, die während der Amplifizierung der Library und der Sequenzierung entstehen, bioinformatisch eliminiert werden.
Die Sonden hybridisieren zunächst mit ihren komplementären Enden an die Zielregionen der genomischen DNA. Genfusionen können bei einigen Kits zusätzlich auf RNA-Ebene detektiert werden. Hierzu wird die RNA in cDNA umgeschrieben und in einem Reaktionsgefäß zusammen mit der DNA mit den Sonden hybridisiert. Sonden für die Erfassung von Genfusionen auf RNA-Ebene sind nicht durch einen Loop verbunden, um eine Kombination aller potenzieller Sondenpartner und damit eine umfassendere Analyse von Genfusionen zu ermöglichen. Während der Extension-Ligation-Reaktion werden die Sonden an ihren 3‘-Enden durch eine Polymerase entlang der Ziel-DNA mit komplementären Nukleotiden verlängert, dadurch entsteht eine Kopie der Target-Region. Durch eine Ligase werden die kopierten Sequenzen mit den 5‘-Enden der Sonden ligiert, so werden zirkuläre DNA-Moleküle generiert. Verbleibende lineare DNA-Stränge (Template-DNA, cDNA und nicht hybridisierte Sonden) werden durch den anschließenden Nuklease-Verdau entfernt. Die verbleibenden ringförmigen DNA-Moleküle werden durch eine PCR-Reaktion mit wenigen Zyklen amplifiziert. Über die PCR-Primer werden gleichzeitig Index-Sequenzen sowie Bindestellen für die Sequenzierprimer und für die Flow Cell an die Libraries angefügt. Abschließend werden die Libraries in dem einzigen Aufreinigungsschritt des HANDLE-Protokolls über magnetische Beads gereinigt.
Alle Reaktionen finden ab der Sonden-Hybridisierung bis zur PCR in einem Reaktionsgefäß pro Probe statt, dadurch wird die Gefahr einer Probenverwechslung minimiert.
